Enzima bioluminescente

Com o objetivo inicial de entender a origem e evolução das enzimas luciferases – responsáveis pela bioluminescência de vagalumes – pesquisadores da UFSCar produziram uma nova enzima luciferase a partir de enzimas não-luminescentes da classe das AMP/CoA-ligases, denominada Enzima AMP-Coa-Ligase Ativa de (Zophobas morio), Luciferase Desenvolvida por Engenharia Genética, Processo para Implementar Atividade Luciferásica em AMP-Coa Ligases, Processo de Inibição da Atividade Luminescente da Protoluciferase para a Pré-Seleção e Bioprospecção de Substratos Carboxílicos, Biossensor Celular e Composição Farmacêutica. A patente foi desenvolvida no Departamento de Física, Química e Matemática do campus Sorocaba da UFSCar, pelos pesquisadores Vadim Viviani e Rogilene Prado.

Como toda enzima (uma proteína), as enzimas luciferases de vagalumes se originaram a partir de outras enzimas ancestrais durante a evolução biológica. Com o tempo, as enzimas se transformam através de mutações em sua estrutura molecular, modificando e até ganhando novas funções catalíticas. No caso da luciferase de vagalumes, seus ancestrais são as enzimas AMP-CoA-Ligases que atuam, de maneira simples, na ativação de ácidos orgânicos nos sistemas biológicos. Estas enzimas desempenham papéis biológicos diferentes tanto em bactérias, quanto em seres humanos.

O que elas tem em comum, além de estrutura molecular semelhante (determinada pela sequência de aminoácidos), é a catálise da ativação de ácidos orgânicos, utilizando ATP (molécula que guarda energia química nos organismos vivos) e, em geral, CoA (coenzima-A, outro cofator essencial para as células vivas). Elas podem participar em processos metabólicos mais variados, desde a biossíntese composta como pigmentos, a detoxificação de compostos orgânicos xenobióticos, o metabolismo de gordura, dentre outras funções. O composto ácido pode ser ácido graxo, ácido orgânico tóxico, ou a luciferina do vagalume. Para ativar o ácido orgânico, essas enzimas buscam ATP celular que reage com o composto ácido, produzindo intermediário denominado adenilato. Numa segunda etapa enzimática, o composto ácido reage com a CoA, gerando o produto ácido-CoA, que pode ter diferentes destinos metabólicos.

No caso da enzima luciferase, ela tem a função de produzir luz. Para isto, ela catalisa primeiro a ativação da luciferina (composto ácido do vagalume) por ATP, como faria outra enzima da família das AMP-CoA-ligases, entretanto, na segunda etapa, a luciferase dos vagalumes catalisa a oxidação do adenilato de luciferina, produzindo dióxido de carbono, água, AMP e luz visível. Mas ainda existia uma lacuna a respeito da capacidade de catalisar a segunda reação de oxidação produzindo luz, que teve origem na AMP-ligase ancestral, desenvolvendo uma luciferase.

Em 1996, Vadim Viviani deu um passo fundamental na compreensão sobre a origem das luciferases durante seu doutorado, descobrindo uma enzima luciferase num inseto não-luminescente utilizado como isca de pesca. O pesquisador conta que sempre teve interesse em entender a origem e evolução da bioluminescência nos vagalumes e outros organismos e, pensando nisso, começou a procurar esse tipo de enzima em vários tecidos, encontrando-o na larva deste inseto. O inseto possuía a enzima, mas não possuía o substrato luciferina para produzir a luz, então quando ele recebia este substrato, produzia luminescência fraca, que não podia ser enxergada sem o auxílio de um equipamento sensível.

Após cerca de dez anos de pesquisa desde a descoberta desta enzima, o pesquisador conseguiu cloná-la, obtendo o material necessário para produzi-la em escala de laboratório. A partir daí, a pesquisa atuou na caracterização da enzima e, posteriormente, iniciou-se seu processo de mutagênese a fim identificar que partes (amino-ácidos) de sua molécula eram responsáveis por gerar a fraca luminescência como a luciferase.

Segundo o pesquisador Vadim Viviani, do ponto de vista básico, o objetivo da invenção era compreender a origem e evolução das luciferases. Mas do ponto de vista aplicado, uma vez descobertos os determinantes estruturais responsáveis pela catálise da reação luminescente, seria possível desenvolver uma nova enzima luciferase a partir de uma AMP-CoA-ligase. A enzima clonada foi caracterizada pela doutoranda Rogilene Prado. Em seguida, através de técnicas de mutagenese sitio-dirigida, os pesquisadores identificaram as partes da molécula desta enzima responsáveis pela catálise da reação de oxidação da luciferina e pela produção de luz visível. Os pesquisadores acharam uma parte essencial na estrutura da AMP-CoA-ligase, que uma vez modificada para ficar parecida com a luciferase de vagalumes, tornaram a enzima quase tão eficiente quanto a luciferase, produzindo luz de cor laranja. Esta é a primeira vez que alguém desenvolve uma enzima luciferase luminescente por engenharia genética, utilizando uma enzima AMP-CoA-ligase não-luminescente.

Dentre as aplicações da nova enzima, o professor destaca que ela pode ser utilizada como uma nova luciferase. Além disso, como a função natural desta enzima no inseto não-luminescente está relacionada com a ativação de diferentes compostos ácidos exógenos ou xenobióticos, como a própria luciferina do vagalume, “há evidências de que a enzima esteja envolvida no processo de excreção e detoxificação de ácidos orgânicos. Inclusive uma das ideias da patente é a possibilidade de utilizar a enzima luminescente para detectar também a presença de compostos tóxicos em insetos e, eventualmente, em outros organismos para ajudar no processo de detoxificação”, declarou o professor. Ou utilizar a luminescência da enzima para detectar a presença de ácidos tóxicos que a inibem.

A invenção também pode ter as aplicações corriqueiras das luciferases existentes no mercado, mas com o diferencial de possuir atividade com substratos ácidos distintos, ou seja, dependendo do tipo de substrato orgânico que ela ativar, poderá ter uma nova aplicação. Isso permite usar a luminescência para detectar se ela está na presença do ácido tóxico. Segundo Viviani, idealizador e responsável pela invenção, os resultados possibilitam o desenvolvimento de novas enzimas luciferases a partir de enzimas AMP-CoA-ligases não-luminescentes.