Bioluminescência para biossensores

Enzimas luciferases de vagalume que produzem luz podem ser utilizadas para várias finalidades bioanalíticas como para medir a presença de ATP – que é a molécula que conserva energia nas células vivas; para avaliar o estado fisiológico e viabilidade celular; para medir biomassa; e uma aplicação muito usada nos últimos anos: o gene da luciferase como marcador de eventos celulares, como no monitoramento da expressão gênica na célula, na marcação de eventos celulares ou das células para acompanhar a disseminação de doenças patogênicas em modelos animais e desenvolver novas terapias. Essa gama de aplicações já é utilizada por outras luciferases no mundo e deu origem à patente Luciferase de Macrolampis SP como Gene Repórter DUAL em Biossensores Simultâneos de Expressão Gênica e Variações de Intracelulares de PH, Concentrações de Fosfato e Cátions Divalentes de Metais Pesados desenvolvida pelo professor Vadim Viviani do Departamento de Física, Química e Matemática do campus Sorocaba da UFSCar.

O professor, que investiga estrutura e função de luciferases há mais de 15 anos, começou a perceber que as enzimas luciferases de vagalumes possuíam sensibilidade ao pH, mudando a cor da luz verde-amarela em pH alcalino para vermelha em pH-ácido. Essa variação da cor da bioluminescência ao pH, embora para algumas finalidades analíticas fosse indesejável, motivou o professor a pesquisar a propriedade para acompanhar mudanças de pH e outros fatores químicos no interior das células. Assim, em 2005, ele clonou e investigou a luciferase do vagalume Macrolampis, que era especialmente sensível ao pH, resultando na patente que utiliza a luciferase como biossensor de pH.

O diferencial do invento é que, pela primeira vez, houve a proposta de utilizar a propriedade da mudança da cor da luz mediada pelo pH como biossensor para mudanças de pH intracelulares em condições fisiológicas diversas. Ou seja, ela pode ser utilizada como sensor de dois eventos celulares: a mudança de cor da luz medida pelo espectro sinaliza mudanças de pH intracelular, enquanto que a intensidade da luz sinaliza a quantidade de ATP ou a atividade de expressão gênica. Anteriormente, dois eventos celulares diferentes empregavam duas luciferases que emitiam diferentes cores de luz, cada qual para um evento. Neste caso, uma única luciferase desempenha os dois papeis.

Quando a célula está viva, ela precisa de um composto que armazene sua bioenergia conhecido como o Trifosfato de Adenosina ou simplesmente ATP – nucleotídeo responsável pelo armazenamento de energia em suas ligações químicas. A reação bioquímica de um vagalume envolve a oxidação exotérmica por oxigênio do ar da luciferina, que depende da presença de ATP e da enzima luciferase, resultando na produção de luz. Quando há a ausência do ATP, não pode haver produção de luz porque essa reação depende de sua energia inicial (a energia da luz emitida vem da própria reação de oxidação da luciferina pelo oxigênio).

Uma célula que foi transformada geneticamente com o gene da luciferase do vagalume irá produzir a luciferase e, na presença de luciferina (providenciada exogenamente), ATP e oxigênio (que se encontram naturalmente na célula), irão produzir bioluminescência. Este é o princípio da utilização da luciferase como gene repórter para analisar a expressão gênica em células. Quando ela precisa ser estudada numa célula ou tecido, este é acoplado ao gene da luciferase, e a expressão gênica é acompanhada pela bioluminescência. Este princípio é o mesmo utilizado para marcar células normais ou patogênicas com a bioluminescência, ou para criar um biossensor que usa células bioluminescentes.

Para avaliar a eficácia de uma droga como um antibiótico, uma bactéria que causa uma doença pode ser marcada geneticamente com a enzima luciferase. No modelo animal, quando determinadas drogas farmacêuticas têm efeito contra a bactéria, elas podem combatê-la e a luminescência desaparece junto. Se a droga não for efetiva, a luminescência persiste e espalha a infecção. O mesmo princípio vale para células cancerígenas, que quando isoladas, podem ser marcadas com a luciferase. A metástase transformada é inoculada numa cobaia ou cultura de células, e o processo é acompanhado pela bioluminescência. Se o câncer se espalha ou diminui, sua luminescência fará o mesmo. Desta forma, pode-se avaliar se drogas anticancerígenas têm efeito ou não, auxiliando na descoberta de novos fármacos.
A enzima clonada em 2004 foi submetida à patente quando o professor atuava na UNESP de Rio Claro em 2005, justamente quando foi publicado o primeiro artigo sobre a enzima, levando um ano para ser desenvolvida. Mais recentemente a UFSCar assumiu a titularidade da patente, pois o pesquisador trouxe a tecnologia para a instituição.

Segundo Vadim Viviani, além de ser utilizada para aplicações já empregadas por outras luciferases, a patente pode acompanhar mudanças intracelulares de pH e concentração de metais pesados em processos biológicos naturais e patológicos, como a apoptose – processo fisiológico em que a célula doente se autossuicida para preservar o organismo. Dentro desta gama de aplicações, uma que está sendo desenvolvida no laboratório da UFSCar, resultado de uma pesquisa de mestrado, já apresenta resultados positivos: o gene da enzima utilizado em bactérias para desenvolver biosensores celulares de toxicidade ambiental de águas. Nesta aplicação, uma bactéria é transformada com o gene da luciferase, tornando-se bioluminescente e responsiva a agentes tóxicos que diminuem a bioluminescência.

Entretanto, a vertente biomédica apesar de apresentar o maior potencial de uso, podendo utilizar a luciferase para acompanhar mudanças fisiológicas e patológicas em células de mamíferos, ainda não foi explorada. A tecnologia de Imagem por Bioluminescência está revolucionando os testes de citotoxicidade e bioensaios relativos a fármacos e produtos químicos como cosméticos, substituindo os testes em modelos animais para culturas de células, o que representa progresso ético e financeiro. Para a aplicação deste invento em células de mamíferos, o laboratório conta com a cooperação do grupo de pesquisa do Nat. Inst. Adv. Industial Science and Technology (AIST, Tsukuba, Japão) especializado na aplicação da bioluminescência em células e mamíferos e que já colabora com a UFSCar há alguns anos.

Atualmente, o grupo Bioluminescência e Biofotônica, sediado no Laboratório de Bioquímica e Biotecnologia de Sistemas bioluminescentes (www.biolum.net) no campus de Sorocaba é um dos líderes mundiais no estudo de enzimas luciferases, trabalhando especificamente no desenvolvimento molecular destas enzimas, com o objetivo de melhor aplicá-las em biossensores ambientais e em células de mamíferos de maneira mais direta na área biomédica.